GB/T 34331-2017
黃瓜綠斑駁花葉病毒透射電子顯微鏡檢測(cè)方法
Test method of Cucumber green mottle mosaic virus by transmission electron microscopy
GBT34331-2017, GB34331-2017
儀器設(shè)備與試劑準(zhǔn)備
| 類別 | 項(xiàng)目 | 規(guī)格要求 |
|---|---|---|
| 核心設(shè)備 | 透射電子顯微鏡 | 加速電壓60-80kV |
| 超薄切片機(jī) | 配鉆石刀/玻璃刀 | |
| 高速離心機(jī) | ≥10,000rpm | |
| 正置光學(xué)顯微鏡 | 帶亞甲基藍(lán)染色功能 | |
| 關(guān)鍵試劑 | 戊二醛 | 分析純，2-3%濃度 |
| 四氧化鋨 | 晶體，1%工作液 | |
| 磷鎢酸 | 2%溶液(pH6.8) | |
| 環(huán)氧樹脂包埋劑 | Spurr's或Epon812 | |
| CGMMV多抗血清 | 1:10-1:100稀釋 |
檢測(cè)操作流程
1. 試樣制備
- 組織粗汁液：取1g病葉與1mL磷酸緩沖液(pH7.0)研磨，離心取上清
- 提純病毒：用0.01mol/L磷酸緩沖液稀釋至適宜濃度
- 超薄切片樣品：切取1mm3病組織塊，2%戊二醛4℃固定2h
2. 負(fù)染色技術(shù)
懸滴法（常規(guī)檢測(cè)）
- 銅網(wǎng)滴加病毒懸液，濾紙吸除多余液體
- 2%磷鎢酸負(fù)染色1-2分鐘
- 干燥后電鏡觀察（4000-20000倍）
免疫吸附法（特異性檢測(cè)）
- 銅網(wǎng)與稀釋抗血清反應(yīng)15分鐘
- 磷酸緩沖液漂洗后與病毒懸液孵育30分鐘
- 雙重漂洗后負(fù)染色觀察
3. 超薄切片制備
| 步驟 | 參數(shù) | 關(guān)鍵控制點(diǎn) |
|---|---|---|
| 前固定 | 2%戊二醛，4℃ 2h | 磷酸緩沖液(pH7.2) |
| 后固定 | 1%四氧化鋨，4℃ 1-2h | 避光操作 |
| 脫水 | 乙醇梯度(50%-100%) | 每級(jí)10-15分鐘 |
| 包埋 | 環(huán)氧樹脂浸透12h | 70℃聚合8h |
| 切片 | 50-100nm厚度 | 鉆石刀操作 |
| 染色 | 醋酸鈾+檸檬酸鉛 | 雙重染色各15分鐘 |
結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
- 陽性特征：觀察到直徑18nm、長度300nm的剛直桿狀病毒粒子
- 超薄切片：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見平行排列的病毒聚集體
- 陰性對(duì)照：健康組織樣品無上述特征
生物安全要求
- 所有廢棄物需121℃高壓滅菌30分鐘
- 病毒樣品保存于-20℃專用冰箱
- 操作臺(tái)面每日用10%次氯酸鈉消毒
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- 標(biāo)準(zhǔn)號(hào)
- GB/T 34331-2017
- 別名
- GBT34331-2017
GB34331-2017 - 發(fā)布
- 2017年
- 總頁數(shù)
- 15頁
- 發(fā)布單位
- 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局、中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)
- 當(dāng)前最新
- GB/T 34331-2017
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了應(yīng)用透射電子顯微鏡對(duì)黃瓜綠斑駁花葉病毒進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)的技術(shù)要求和規(guī)范。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢驗(yàn)檢疫與鑒定。
| 術(shù)語 | |
|---|---|
| 病毒 | virus |
| 病毒粒子 | virion |
| 負(fù)染色 | negative stain |
| 超薄切片 | ultrathin section |
| 免疫電子顯微術(shù) | immunoelectronmicroscopy |
GB/T 34331-2017 中提到的儀器設(shè)備
專題
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