細(xì)胞破碎技術(shù)主要方法
樣品前處理-細(xì)胞破碎技術(shù)
細(xì)胞破碎技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，由于細(xì)菌、酵母、真菌、植物都有細(xì)胞壁，但成分不同，且同類細(xì)胞結(jié)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不同，因此其細(xì)胞壁的堅固程度不同，總體呈現(xiàn)遞增態(tài)勢。動物細(xì)胞雖沒有細(xì)胞壁，但具有細(xì)胞膜，也需要一定的細(xì)胞破碎方法來破膜，達(dá)到提取產(chǎn)物的目的。細(xì)胞破碎的方法主要分為化學(xué)法和機(jī)械法兩大類。具體如下：
化學(xué)法? ?
滲透沖擊破碎法
?方法：滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，運用滲透壓的變化引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。
反復(fù)凍融法? ?
?方法：將細(xì)胞放在低溫下冷凍(約-15℃)，然后在室溫中融化，反覆多次而達(dá)到破壁作用。
酶溶破碎發(fā)法? ?
?方法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、脂酶等，將細(xì)胞壁分解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。
化學(xué)試劑法? ?
?方法：某些有機(jī)溶劑(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來。SDS(十二烷基磺酸鈉)是典型的陰離子表面活性劑
方法 | 技術(shù) | 原理 | 效果 | 成本 | 應(yīng)用 |
化學(xué)法 | 滲透沖擊 | 滲透壓破壞細(xì)胞 | 溫和 | 便宜 | 動物組織均質(zhì)物或細(xì)胞懸液 |
酶消化法 | 細(xì)胞壁被消化，使細(xì)胞破碎 | 溫和 | 昂貴 | 細(xì)菌或酵母 | |
增溶法 | 表面活性劑溶解細(xì)胞壁 | 溫和 | 適中 | 動物或植物組織均質(zhì)物，提取DNA | |
脂溶法 | 有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁并使之失穩(wěn) | 適中 | 便宜 | 動物或植物組織均質(zhì)物，提取DNA | |
堿處理法 | 堿的皂化作用使細(xì)胞壁融解 | 劇烈 | 便宜 | 菌液質(zhì)粒DNA提取，RNA提取 |
機(jī)械法? ?
組織搗碎機(jī)
?方法：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。
?特點：一般用于動物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩的葉芽等，轉(zhuǎn)速可高達(dá)10000rpm/M以上。由于旋轉(zhuǎn)刀片的機(jī)械切力很大,制備一些較大分子如核酸則很少使用。
勻漿器
?方法：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細(xì)胞研碎。勻漿器的研缽磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙保持在十分之幾毫米距離。
?特點：此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動物臟器組織。
?存在的問題：較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性菌以及有些亞細(xì)胞器，質(zhì)地堅硬，易損傷勻漿閥者，不適合用該法處理。
研磨
?原理：將液氮預(yù)凍的樣本放入研缽內(nèi)研磨
?特點：多用于堅硬植物材料，研磨時常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨劑，以提高研磨效果。
超聲波
?原理：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，超聲對細(xì)胞的作用主要有熱效應(yīng)，空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。
?特點：處理少量樣本，操作簡單，重復(fù)性較好，節(jié)省時間;多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎，如用大腸桿菌制備各種酶。
?存在問題：超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活；大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施；對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。
高壓勻漿
?方法：利用超高壓能量使樣品通過狹縫瞬間釋放，在剪切效應(yīng)、空穴效應(yīng)、碰撞效應(yīng)的作用下，使細(xì)胞破碎。全過程在4~6℃低溫循環(huán)水浴中進(jìn)行，保持原有物質(zhì)活性。
?特點：可連續(xù)操作，適合于處理大量樣本，主要用于從微生物樣本中提取蛋白等胞內(nèi)產(chǎn)物。
振蕩珠擊破碎
?方法：將等體積的小量組織樣品與高密度的磁珠或鋼珠等放入可密封的2ml螺旋蓋微量管中，設(shè)定振蕩速度、振蕩時間即可。
?特點：此方法是目前最快且一次可處理最多樣品的方法。一臺機(jī)器最多可以在一天處理2400支樣品。適合小量、多樣的實驗。
方法 | 技術(shù) | 原理 | 效果 | 成本 | 應(yīng)用 |
機(jī)械法 | 勻漿法 | 細(xì)胞被攪拌器劈碎 | 適中 | 適中 | 動物組織 |
研磨法 | 細(xì)胞被研磨物磨碎 | 適中 | 便宜 | 植物組織 | |
超聲波法 | 用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎 | 適中 | 昂貴 | 細(xì)胞懸液 | |
高壓勻漿法 | 須使細(xì)胞通過的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎 | 劇烈 | 適中 | 細(xì)菌提取蛋白，酵母 | |
珠磨破碎法 | 細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎 | 劇烈 | 便宜 | 組織均質(zhì)物 |
