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蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理的方法

2021.8.23

要回答這個(gè)問題，首先需要理解樣品前處理需要達(dá)到的目的：減少人為降解和修飾，并且盡量多的釋放肽段。

整個(gè)過程可以分為以下流程：先從組織、體液或細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，拿到蛋白混合溶液（根據(jù)你的研究目的，可以對(duì)蛋白先做分離，或者不分離），接下來還原烷基化（還原的過程是將蛋白的二硫鍵打開，然后烷基化可以修飾巰基，防止游離的巰基再生成二硫鍵）處理，并酶解成肽段。

1，樣品的收集與保存

組織樣品

1) 對(duì)于人體手術(shù)切除的組織，有條件的話，最好用PBS（磷酸緩沖鹽溶液，作為溶劑，起溶解保護(hù)試劑的作用）取完之后直接去血。如果沒有去血，可以-80℃液氮保存，干冰運(yùn)輸。

2）對(duì)于小鼠、大鼠、兔子之類的組織樣品，建議用灌流的方式來去血，尤其是像肝臟、胃、心臟這類大的組織，可以直接用灌流的方式去血，去得最干凈。其次的方案是在后期剪碎的時(shí)候去血。

細(xì)胞樣品

常規(guī)實(shí)驗(yàn)，建議收到5*1E6~1E7個(gè)細(xì)胞以上的樣品量（有些實(shí)驗(yàn)需要的樣品量會(huì)少一些，后面會(huì)詳細(xì)講）。細(xì)胞取好后，首先用PBS清洗一下細(xì)胞表面，因?yàn)榇蟛糠峙囵B(yǎng)基里面都含有血清，這部分血清得洗干凈了先~

如果是做分泌蛋白研究的話，首先用PBS清洗樣品幾次，再用條件培養(yǎng)基（不含有血清的培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞情況，大概12個(gè)小時(shí)以后，離心，去掉細(xì)胞碎片，取上清，就能提取到分泌蛋白了。

血清樣品

1）血漿樣品：可以通過醫(yī)院常用的EDTA抗凝管進(jìn)行收集，收集到的血漿會(huì)呈懸浮狀態(tài)，離心去掉血細(xì)胞。

2）血清樣品：現(xiàn)在大部分研究都直接針對(duì)血清樣品，它的成份更簡單，沒有凝集素，沒有大量的血細(xì)胞，針對(duì)性會(huì)更強(qiáng)。收集血清樣品時(shí)，直接把血清吸到管子里，室溫靜置讓它凝結(jié)，上清黃色部分就是血清樣品啦。
2，研磨或超聲破碎樣品，為了減少人為操作引入的修飾，通常會(huì)準(zhǔn)備大量的冰，進(jìn)行冰上的操作。同時(shí)還需要加入蛋白酶抑制劑，防止在操作過程中蛋白被樣品中自帶的蛋白酶降解掉。

3，充分熔接蛋白質(zhì)，如果蛋白沒有充分溶解，能提取到的蛋白就會(huì)很少，達(dá)不到研究目的。

4，充分解旋蛋白質(zhì)，通常，蛋白質(zhì)都是成球狀的穩(wěn)定狀態(tài)，解旋蛋白質(zhì)就是將球狀蛋白中的二硫鍵打開，讓它形成鏈狀結(jié)構(gòu)，以便進(jìn)行下一步酶切。

5，酶解蛋白質(zhì)，一般會(huì)用多種酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解。

6，去除雜質(zhì)，我們要知道，質(zhì)譜是一個(gè)非常靈敏的儀器，它檢測(cè)的是多肽的質(zhì)荷比。所有的鹽類，以及所有會(huì)進(jìn)行離子化的雜質(zhì)，都會(huì)干擾到肽段的檢測(cè)。所以我們會(huì)要求進(jìn)入質(zhì)譜之前的蛋白樣品非常干凈。在蛋白水平及肽段水平都會(huì)進(jìn)行去除雜質(zhì)的步驟。