樣品前處理技術
如何對越來越復雜的樣品基質(zhì)進行痕量分析及其樣品前處理已成為業(yè)界的一大挑戰(zhàn)。為了滿足全球日益增長的人口需要，食物產(chǎn)量需要很大的提升，這也導致了多種農(nóng)藥的使用。但農(nóng)藥的施放有時并非完全合理，有時農(nóng)產(chǎn)品本身不需要，也會被施放，所以檢測工作者必須不斷改善檢測技術，對越來越多的農(nóng)藥進行痕量檢測。而此時多類農(nóng)藥殘留的分析方法就得到了高度的關注，特別是在食物供應頻頻出現(xiàn)安全事件的階段。
傳統(tǒng)的樣品處理技術經(jīng)歷了液固萃取、液液萃取、固相萃取幾個階段。隨著高靈敏、選擇性的LC-MS、GC-MS以及LC-MS/MS的快速發(fā)展，美國農(nóng)業(yè)部的Steven J. Lehotay 博士和德國的化學家Michelangelo Anastassiade共同研發(fā)了一種用于蔬菜、水果中痕量農(nóng)藥殘留分析的新方法，即QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged and safe）。將水溶液中的固體樣品加鹽后經(jīng)過乙腈萃取，然后通過液固萃?。ɑ|(zhì)分散固相萃取，dispersive-SPE）去除乙腈中存在的大部分干擾物，最后通過一種或多種檢測技術進行分析。通過與LC-MS、GC-MS以及LC-MS/MS的結合使用，QuEChERS得到了長足的發(fā)展，成為了全球檢測水果、蔬菜中農(nóng)殘時的標準樣品處理方法。除此以外，其應用也涉及到越來越多的不同領域，比如肉類、血液樣品、酒、甚至土壤中抗生素、藥物、濫用藥、還有其他污染物的檢測。
方法的主要改進
Ron Majors：QuEChERS最早在2003年面世，從開發(fā)到現(xiàn)在，你們對該方法做了哪些改進？
Lehotay：在QuEChERS的構思階段，我們對大范圍的代表性農(nóng)藥、樣品進行了多次的實驗，對每次提取、凈化步驟進行評估。2003年的QuEChERS版本對于被測物及其基質(zhì)來說是不錯的，當我們在對不同樣品中上百種農(nóng)藥進行方法驗證時，發(fā)現(xiàn)大概有10種農(nóng)藥的回收很容易受pH的影響，而使用pH＝5的緩沖液是不錯的解決方法，因此在之后的方法中我們也開始注意緩沖液的使用。這是方法的第一個改進，但不足之處在于緩沖液的使用也會導致一些雜質(zhì)的增多。
其次， C18填料與PSA一起添加能明顯地改善某些樣品的凈化效果，特別是那些富含油脂的樣品，比如橄欖油，而且不會造成被測物的損失。有些化學家采取冷凍的方法去降低脂類的干擾，這同時也能除去一些之前萃取中帶入的雜質(zhì)，但是相比之下，C18無疑更快、更容易，而且去脂效果與冷凍法相當。目前，歐盟標準方法EN 15662已經(jīng)收錄了添加C18的方法，但遺憾的是，AOAC官方方法2007.01中尚沒有提及這個方法。另外，有時遇到含有較多油脂的谷物時，可以提高d SPE中PSA的用量。
最后，葉綠素、類胡蘿卜素這類雜質(zhì)的去除可以如CEN 標準方法156627所述，加入少量石墨化碳黑或者加入美國UCT公司的ChloroFiltr吸附劑，但缺點是會對某些平面結構的農(nóng)藥造成25％左右的損失。
方法開發(fā)中的難題
Ron Majors：在開發(fā)QuEChERS方法時遇到的幾個最大的困難是什么？
Anastassiades：我們并不認為在開發(fā)這個方法時遇到過什么大的挫折。QuEChERS自從在第四屆歐洲農(nóng)殘專題討論會公布后反響巨大并從此得到快速發(fā)展。我們把QuEChERS方法與歐洲沿用了15~20年的方法進行比較，發(fā)現(xiàn)前者能節(jié)省95％的溶劑（10ml Vs 535ml），95％的耗材成本，還有90％的時間。查看歐洲每年對水果、蔬菜進行的農(nóng)藥檢測報告，就會發(fā)現(xiàn)在2009年130~150個參加比對的實驗室中近40％是使用QuEChERS方法的。私人實驗室由于更加考慮成本，QuEChERS的采用率更高至近70％。
圖1.? 與近年發(fā)展快速的LC-MS、GC-MS以及LC-MS/MS結合使用，QuEChERS也得到了長足的發(fā)展。
QuEChERS方法使用中的最大困難恰恰來自于其優(yōu)勢：靈活性。對于上百種樣品、上百種農(nóng)藥而言，即使對方法進行一些調(diào)整也能得到較高的回收率。有人曾經(jīng)說過“分析方法就像是牙刷，每個人都情愿只用自己的一個”。比如，我想用檸檬酸緩沖液（相對低的緩沖容量），Lehotay卻想用醋酸緩沖液（較高濃度，擁有更大的緩沖容量）。我們都有各自的理由，但最后兩個方法也都被許多實驗室在不同的食物上進行了充分的驗證。
檢測中方法的調(diào)整是必須的，但是現(xiàn)在許多時候，它給人的印象只是僅僅為了標新立異地寫一篇文章，一篇報告，而這些調(diào)整往往使方法變得更加耗時、更易受影響、花費更大。
靈活性帶來的另外一個問題是，QuEChERS方法能適應不同的樣品大小、不同的進樣體積、不同的溶劑。因此，供應商根據(jù)全球不同實驗室的要求設計了眾多不同的產(chǎn)品，可供選擇的規(guī)格過多導致分析時容易產(chǎn)生混亂。
或許所有多種類農(nóng)殘分析方法中最大的困難就是對于某種農(nóng)藥（比如克菌丹，敵菌丹，滅菌丹和百菌清）不能得到高的、持續(xù)穩(wěn)定的回收率。酸性環(huán)境能減少這類農(nóng)殘的損失，但是這些被測物卻容易在非酸性的樣品中發(fā)生降解，甚至樣品還沒萃取時就會出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象。不幸的是，這類化學物不適用于液質(zhì)分析，氣質(zhì)分析也存在問題。在氣質(zhì)分析時，必須嚴格控制好相關條件才能得到高質(zhì)量的檢測結果，而這在日常檢測中是不大可能的。因此，QuEChERS被一些人批評還不夠完美。在一些原創(chuàng)的QuEChERS論文中，通過使用被測物保護劑（APs），可以減少這類麻煩出現(xiàn)。
適用范圍不斷擴大
Ron Majors：雖然QuEChERS剛開始時是針對水果、蔬菜中多農(nóng)殘?zhí)崛〉囊粋€方法，但是現(xiàn)在它已被應用在越來越多領域如獸藥，多環(huán)芳烴PAHs與抗生素等，檢測越來越多的不同樣品，如血漿、肉、土壤等。這些方法也許并沒有像你們以前那樣小心地做過室間測試和評估，你們?nèi)绾慰创@種現(xiàn)象？
Lehotay：我們很開心QuEChERS能被擴展使用于不同的領域。方法在工作中的使用效果，要具體問題具體分析，這取決于是否有科學依據(jù)，而與QuEChERS自身無關。但在所有新開發(fā)的方法中，大家必須要注意評估其效果以及有效性。
從一開始，我們并沒有對QuEChERS進行ZL控制，首先，我們覺得化學方法或基質(zhì)萃取是不能進行ZL控制的（畢竟，在使用毛細管前Tswett已用吸附劑進行色譜分離），其次，我們都認為，如果不對此插手，QuEChERS方法可以應用到更多的領域。我們的團隊都沒有從QuEChERS的商品化中得到利益。
為了“保護”QuEChERS，我們所做的就是對國際官方方法的驗證以及認證機構（AOAC和CEN）進行支持。AOAC方法2007.01與CEN標準方法EN15622都是經(jīng)過驗證的方法，其調(diào)整后的版本只要經(jīng)過充分的驗證，都是可以接受的。
但我們也注意到，在方法的開發(fā)以及次數(shù)有限的驗證試驗中，加標樣品雖然均能得到良好、穩(wěn)定的回收率，但是，現(xiàn)實中某些基質(zhì)與分析物之間具有強烈的作用，常規(guī)分析中也會出現(xiàn)一些儀器維護問題，這些都可能導致無法得到好的回收率。比如，QuEChERS在土壤分析中的應用，因為這需要用到更強的提取環(huán)境——加壓萃取（PLE）或者索氏提取而不是手搖式萃取，以克服土壤－沉淀物之間的強烈吸附力。而許多食品中并不會有這么強的作用力，所以手搖式萃取已可獲得令人滿意的回收率。
圖2.? 2003版方法、AOAC官方方法2007.01、CEN標準方法 EN 15662。
Ron Majors：QuEChERS最初是為痕量農(nóng)殘分析而開發(fā)的，使用這一技術以從事農(nóng)藥殘留檢測的實驗室為主，這類實驗室都非常熟悉代表性樣品的采集以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計。而現(xiàn)在QuEChERS已被許多非農(nóng)藥實驗室用于各種各樣的痕量分析，這類實驗室往往缺乏像農(nóng)殘分析師那樣的經(jīng)驗豐富的專業(yè)人士，你們認為QuEChERS方法是否會因為樣品采集不具代表性而出現(xiàn)不理想的結果？
Anastassiades：其實不僅是QuEChERS，使用所有檢測方法時我們都要考慮該方法對樣品的要求。我們在論文、報告中一再強調(diào)樣品的采集以及均質(zhì)化是QuEChERS步驟中非常重要的環(huán)節(jié)，這樣也有利于得到更小的樣品顆粒，對于之后的搖動萃取也有幫助。甚至可以夸張地說，用于粉碎樣品的市值5000美元的粉碎機，其重要程度并不低于價值300000美元的液質(zhì)聯(lián)用儀。
QuEChERS的自動化
Ron Majors：QuEChERS仍然主要是由人工操作，比如手搖萃取和樣品操作等。你們?nèi)绾慰创摷夹g的自動化？
Lehotay：當前QuEChERS面臨的問題不是使其更快、更簡單，而是使其更便捷，而自動化往往會使樣品處理花費更多的時間與精力和費用。一個化學工程師手工處理一批樣品往往會比一個普通人在自動處理機上上樣、卸樣要快。幸運的是，當每次只需震搖管子1min時，每個人足以同時應付6~10個提取用的離心管（50ml）。
當然，實驗室的化學工程師們最容易抱怨的問題之一還是他們不太喜歡震搖這個步驟（盡管我們建議可以想像邊聽音樂邊做QuEChERS之舞），另外，不同操作人員的震搖力度也不相同。所以，在QuEChERS的萃取過程中能有一臺強力的震搖機的確會是一個很好的辦法，特別是對于一些有能力的實驗室來說。Anastassiades目前正在研究對食品類樣品進行農(nóng)殘萃取時環(huán)境的影響因素。在大部分情況下，1min的萃取時間已經(jīng)足夠，當然在某些情況下，增大萃取時間還是會顯著提高萃取效率。以一些農(nóng)殘已擴散到蠟質(zhì)層結構的樣品為例，蠟質(zhì)的顆粒樣品明顯需要更長的萃取時間，而自動化的震搖裝置這時就顯得很有必要了。
然而，基質(zhì)萃取這個步驟就無需這種強度的萃取，只要30 s的震搖即可，因此這也不必自動化。半自動的DPX裝置能同時處理20個樣品，其處理量基本與手動操作相當。如果在此用到自動化裝置雖然理論上會減少時間，但是會增加維護成本、儀器停機時間。
殘留化學物分析現(xiàn)在還并不需要像診斷或藥物分析那樣一次處理如此多的樣品，但是如果QuEChERS用于大批量的樣品處理，這時自動化就顯得十分重要了。Gerstel公司正在與DPX等實驗室合作，實現(xiàn)QuEChERS的自動化操作。
基質(zhì)干擾
Ron Majors：萃取過程往往容易受到基質(zhì)干擾，如何克服QuEChERS方法中的基質(zhì)干擾？
Anastassiades：食品類樣品大部分不會出現(xiàn)基質(zhì)干擾（某些干燥的、有油脂的樣品例外）。但也有些復雜樣品（比如茶葉、中藥、香料、肝臟、柑桔油等）無論使用什么方法都會存在基質(zhì)對農(nóng)殘的吸附。因為如果基質(zhì)中含有與被測物結構相似的雜質(zhì)時，很難通過樣品預處理過程除去。而通過一些諸如調(diào)節(jié)萃取劑、調(diào)節(jié)pH、加鹽、改變體積比、加水、吸附劑等手段或許可以起到一定作用。
關于pH的影響，我們發(fā)現(xiàn)要從蘑菇中定量提取尼古丁時，需要調(diào)節(jié)pH至10~11。而從洋蔥、韭菜中提取百菌清時，pH就要調(diào)至2，這樣才能降低基質(zhì)對其的吸附提高回收率，另外對于沙蠶毒素類的農(nóng)藥，低pH值也是必須的。
酸性的除草劑易于形成共價鍵結合的殘留。這類農(nóng)藥是常見的允許合法使用的農(nóng)藥，因此必須在液液提取前將其釋放出來。通常我們可以通過先調(diào)節(jié)pH到12堿解30min，然后再調(diào)回中性進行QuEChERS萃取。
還有一種情況，某類農(nóng)藥采用針對性強的前處理方法能達到很好的回收，但卻會降低另外一些農(nóng)藥的回收，在多種類農(nóng)藥提取時這情況很難難免。
當遇到上述這些復雜的情況時，我們就要依靠色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法來完成。高靈敏度的儀器可以使最終提取液具有更低的樣品濃度（比如某些例子里的0.1g/ml），高選擇性的色譜-質(zhì)譜儀更能使我們忽略與目標物同時出峰的雜質(zhì)。當重現(xiàn)性與檢出限有沖突時，凝膠色譜或者分餾提取液會是一個好的解決方法。但是這時也要考慮檢測結果需要滿足何種要求，比如實驗的時間、成本、勞動力以及儀器設備等各種因素。
配套檢測器
Ron Majors：QuEChERS提取液是比較臟的，如何選擇合適的檢測器？
Lehotay：傳統(tǒng)的通用檢測器FID與UV-DAD并不適應于所有的農(nóng)殘分析。我們必須用一些高選擇性的檢測方法進行補充，比如氣相中的FPD、PFPD、NPD、ELCD、ECD、XSD檢測器、液相中的柱后衍生等等。在LC/MS/MS出現(xiàn)前，較大范圍的極性農(nóng)殘是不在監(jiān)控目錄之中的，這是因為單一的分析方法在實踐操作中顯得太觸襟見肘了。之前的多農(nóng)殘分析方法多是為氣相分析設計的，而QuEChERS聯(lián)合LC/MS/MS就大大提高了農(nóng)殘監(jiān)控的能力。
在LC/MS/MS或者GC/MS/MS的幫助下，我們在典型樣品的分析中很少會遇到雜質(zhì)干擾等情況（除了某些香料和柑橘類植物）。同樣，QuEChERS結合氣相、液相中的選擇性檢測器對比之前的方法也并不能在減少雜質(zhì)干擾上進行大幅的改善。如前所述，QuEChERS只是能在某些分析方法上被采納用以調(diào)整提取和提純。
當今GC/MS特別是LC/MS/MS，被認為在對農(nóng)殘的分析中是必不可少的。許多正被逐漸注意到其毒性并加以銷售監(jiān)管的農(nóng)藥只能通過LC-MS進行檢測。我們也建議那些正為發(fā)展中國家建立出口管制實驗室提供技術、金錢支持的團體，與其幫其投資LC-DAD、GC-NPD或者GC-ECD這些設備，不如直接幫助其一步升級到LC/MS/MS。這樣做投資雖然巨大，但是值得。因為這可以檢測到大部分，特別是最重要的那些農(nóng)藥殘留，大大提高出口產(chǎn)品獲得認可的能力，減少產(chǎn)品被拒入境的困境。
SPE小柱與d SPE
Ron Majors：雖然分散基質(zhì)萃取是QuEChERS中最普通的步驟，我注意到亞洲有些檢測人員，仍然選擇類似SPE小柱的裝置比如雙層填料的小柱（如 GCB/PSA）進行凈化操作，這是一種“化學過濾”。你們是怎樣看待SPE小柱與分散基質(zhì)固相萃取的差別？
Lehotay：是的，SPE小柱的確會比分散基質(zhì)固相萃取更能有效去除雜質(zhì)，但是它會降低某些極性農(nóng)殘的回收，同時也需要更多的時間以及金錢。我們在考慮用分散基質(zhì)固相萃取前，也曾經(jīng)想過用SPE小柱這類化學過濾的方法，但是無水硫酸鎂可能會堵塞篩板。在分散基質(zhì)萃取中必須要用吸水劑把有機層中的水分從7％降到2％（這有助于PSA的凈化以及減少進入GC系統(tǒng)中的水分）。當使用氯化鈣代替硫酸鎂時會達到更低的水分殘留以及更好的凈化效果。該方案已成功用于發(fā)酵茶提取物的凈化，但也有不利之處，對于最高極性的農(nóng)藥甲胺磷，會有大概20％的回收損失。我們也試過用SPE小柱或濾膜，但是最后還是覺得分散基質(zhì)固相萃取效果較好。DPX也是一個選擇，它能過濾含有大于2 um顆粒雜質(zhì)的提取液。
傳統(tǒng)的SPE經(jīng)常被用來進行QuEChERS中的凈化，但是我們發(fā)現(xiàn)與其相比，在農(nóng)殘的檢測上，分散基質(zhì)萃取能提供更高的回收率，而且操作更快，更簡單也更便宜。許多檢測的同行認為SPE是凈化的首選，但是使用傳統(tǒng)的SPE，其實也意味著使用真空箱，真空泵，繁多的預處理步驟（活化，上樣，淋洗，洗脫），收集管，流量控制，溶劑揮發(fā)，小心的操作，還有檢驗人員需要的費力的方法開發(fā)。
d SPE的固定相
Ron Majors：請預計一下分散基質(zhì)萃取固定相的增長需求？如果能設計所謂的 “完美”吸附劑，你們覺得應該要滿足什么要求？
Anastassiades：分散基質(zhì)固相萃取中用到的許多固定相都是來自SPE。對于所謂的完美吸附劑應該能只除去最終提取液中的雜質(zhì)而不損目標物。在所有的食品中，這些雜質(zhì)包括脂肪，碳水化合物，蛋白質(zhì)，水和少量的金屬成份，維生素與因個體而異帶來的各種天然產(chǎn)物。QuEChERS方法中的選擇性提取步驟會除去部分雜質(zhì)（脂肪，水，蛋白質(zhì)，糖分）。分散基質(zhì)萃取步驟的設計就是為了進一步降低殘存雜質(zhì)的，因為這些雜質(zhì)會影響分析從而導致基質(zhì)效應，減少回收，降低設備重現(xiàn)性，比如脂肪和其他酸性物質(zhì)，葉綠素，花青素等其他色素，甾醇類化合物，水。
每毫升提取物加入150mg硫酸鎂，50~150mg PSA，50 mgC18，7.5mg GCB進行萃取是我們所知的對于食品中農(nóng)殘分析的最好分散基質(zhì)固相萃取方案，它能在很廣的濃度范圍內(nèi)提供高的回收率。采用其他吸附劑，改變其用量，調(diào)整pH或溶劑組成，正已烷去脂，這些步驟可能會使得雜質(zhì)去除得更好，但是會降低農(nóng)殘的回收。分子印記技術（MIPs）能針對性地去除某類雜質(zhì)成份，在不降低被測物回收的前提下，這是一個很好的補充。
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