實(shí)驗(yàn)室分析儀器-- 核磁共振的基本結(jié)構(gòu)與原理
核磁共振是電磁波與物質(zhì)相互作用的結(jié)果,是吸收光譜的一種形式,即在適當(dāng)?shù)拇艌?chǎng)條件下,樣品能吸收射頻(RF)區(qū)的電磁輻射而被激發(fā),而且所吸收的輻射頻率取決于樣品的特性;待射頻消失后,由激發(fā)狀態(tài)返回平衡狀態(tài)弛豫過(guò)程中,記錄產(chǎn)生核磁共振光譜。核磁共振的原理如下圖所示。
自從最初觀察到水和石蠟中質(zhì)子有核磁共振現(xiàn)象開始,核磁共振這門學(xué)科作為一種分析手段,經(jīng)歷了前所未有的發(fā)展,迄今為止相關(guān)研究成果已獲得5次諾貝爾獎(jiǎng)。核磁共振好似一棵常青樹,枝繁果碩,正以不同的形式被應(yīng)用到化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品和地質(zhì)學(xué)等領(lǐng)域,其為現(xiàn)代有機(jī)化學(xué)的發(fā)展提供了基礎(chǔ)。現(xiàn)代核磁共振譜學(xué)是一個(gè)已經(jīng)高度發(fā)展、仍在繼續(xù)發(fā)展的學(xué)科,不但繼續(xù)在藥物分析中扮演著重要的角色,而且還被賦予了新的使命,即在蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)和代謝組學(xué)(metabonomics)領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的重要作用。
(1)原子核的磁矩
核磁共振的研究對(duì)象為具有磁矩的原子核。原子核是帶正電荷的粒子,由于旋轉(zhuǎn)便產(chǎn)生一定的磁場(chǎng),稱為磁矩。磁矩與核的角動(dòng)量成正比關(guān)系。但并非所有同位素的原子核都有自旋運(yùn)動(dòng),只有存在自旋運(yùn)動(dòng)的原子核才具有磁矩。
原子核的自旋運(yùn)動(dòng)與自旋量子數(shù)I相關(guān)。I=0的原子核沒(méi)有自旋運(yùn)動(dòng)。I≠0的原子核有自旋運(yùn)動(dòng)。
原子核可按I的數(shù)值分為以下三類。
①中子數(shù)、質(zhì)子數(shù)均為偶數(shù),則I=0,如12C、16O、32S等。
②中子數(shù)與質(zhì)子數(shù)其一為偶數(shù),另一為奇數(shù),則I為半整數(shù),如:
等;
等;
等;
等。
③中子數(shù)、質(zhì)子數(shù)均為奇數(shù),則I為整數(shù),如:2H、6Li、14N等,I=1;58Co,I=2;10B,I=3。
由上述可知,只有②、③類原子核是核磁共振的研究對(duì)象。
(2)核的自旋與核磁共振
核磁共振是無(wú)線電波與強(qiáng)磁場(chǎng)中的自旋核相互作用,引起核自旋能級(jí)躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜。質(zhì)量數(shù)為奇數(shù)具有磁矩的原子核(自旋量子數(shù)I>0)如1H、13C、19F、15N、31P 等原子都具有核自旋的特性?；瘜W(xué)家最感興趣的是1H和13C,因?yàn)樘己蜌涫菢?gòu)成有機(jī)化合物最重要的元素。氫核(質(zhì)子)可以被看作是一個(gè)球形的旋轉(zhuǎn)著的帶電質(zhì)點(diǎn),自旋產(chǎn)生一個(gè)小的磁矩,自旋量子數(shù)I為+1/2或-1/2。類似一個(gè)小磁鐵。當(dāng)質(zhì)子被置于外加磁場(chǎng)時(shí),其磁矩相對(duì)于外加磁場(chǎng)有兩種取向,與外加磁場(chǎng)同向的是穩(wěn)定的低能態(tài),反向的是高能態(tài),兩種自旋狀態(tài)的能量差與外加磁場(chǎng)的磁感應(yīng)強(qiáng)度成正比:
式中,r為磁旋比,其值為26750;h為 Plank 常數(shù);B0?為外加磁場(chǎng)的感應(yīng)強(qiáng)度;ν 為電磁波的輻射頻率。
如果用能量為 ΔE=hν 的電磁波照射處于磁場(chǎng)中的氫核,質(zhì)子就會(huì)吸收能量,從低能態(tài)躍遷到高能態(tài),即發(fā)生“共振”,并在 NMR 儀中產(chǎn)生吸收信號(hào)。從理論上講,無(wú)論是改變外加磁場(chǎng)的磁感應(yīng)強(qiáng)度(掃場(chǎng)),或者是改變輻射的無(wú)線電波的頻率(掃頻),都會(huì)達(dá)到質(zhì)子翻轉(zhuǎn)的目的。能量的吸收可以用電的形式測(cè)定得到,并以峰譜的形式記錄下來(lái),這種由于氫核吸收能量所引起的共振現(xiàn)象,稱為氫核磁共振(1H NMR)。由于頻率差更易準(zhǔn)確地測(cè)定,實(shí)際工作中通常采用掃頻的方法。
下圖表明了外加磁場(chǎng)的磁感應(yīng)強(qiáng)度與質(zhì)子自旋態(tài)改變能量差之間的關(guān)系?？梢钥闯?能量差與 B0?成正比,外加磁場(chǎng)的磁感應(yīng)強(qiáng)度愈大,保持同向的傾向愈強(qiáng),質(zhì)子轉(zhuǎn)向所需的能量愈高。
(a)外加磁場(chǎng) B0=0,ΔE=0;(b)外加磁場(chǎng) B0=1.41T,能量差對(duì)應(yīng)的輻射頻率為60×104Hz(0.6MHz);(c)外加磁場(chǎng) B0=7.04T,能量差對(duì)應(yīng)的輻射頻率為300×104Hz(3MHz)
核磁共振儀如下圖所示。被測(cè)樣品溶解在 CCl4、CDCl3、D2O 等不含質(zhì)子的溶劑中,置于磁鐵之間并不停旋轉(zhuǎn),使樣品受到均勻磁場(chǎng)的作用。固定輻射頻率,調(diào)節(jié)磁強(qiáng)度,當(dāng)滿足上式所示的共振條件時(shí),核磁矩的方向發(fā)生改變,產(chǎn)生共振信號(hào)。
下圖為乙醇的1H NMR 譜圖。譜圖中的信號(hào)可以給出如下信息:
①信號(hào)的數(shù)目即分子中質(zhì)子的種類;
②信號(hào)的位置即分子中每種質(zhì)子的類型;
③信號(hào)的強(qiáng)度即每種質(zhì)子的數(shù)目;
④信號(hào)的裂分即每種質(zhì)子相對(duì)于其他鄰近質(zhì)子的環(huán)境的情況。
(3)信號(hào)的數(shù)目等價(jià)和不等價(jià)質(zhì)子
在一個(gè)分子中,環(huán)境相同的質(zhì)子在相同的外加磁場(chǎng)強(qiáng)度下發(fā)生吸收;環(huán)境不同的質(zhì)子在不同的外加磁場(chǎng)強(qiáng)度下發(fā)生吸收。我們把環(huán)境相同的質(zhì)子說(shuō)成是等價(jià)的。在核磁共振譜中,信號(hào)的數(shù)目表示一個(gè)分子中包含著幾種等價(jià)質(zhì)子,即多少種類的質(zhì)子。如圖5-4所示,乙醇分子中包含著 a、b、c 三種等價(jià)質(zhì)子,產(chǎn)生三組吸收信號(hào)。
等價(jià)是指化學(xué)上的等價(jià),我們可以用尋找異構(gòu)體的方法判斷質(zhì)子是否等價(jià)。例如2-甲基-2-丁烯分子中10個(gè)質(zhì)子均是不等價(jià)的。存在著三種不同類型的甲基和一個(gè)乙烯型質(zhì)子,可產(chǎn)生四種不同的取代產(chǎn)物,見(jiàn)下圖,故在1H NMR 譜中有四種不同的信號(hào)。
(4)化學(xué)位移
原子核是被外部電子所包圍的,這些核外電子由于不停地轉(zhuǎn)動(dòng)而產(chǎn)生一種環(huán)電流,并產(chǎn)生一個(gè)與外加磁場(chǎng)方向相反的次級(jí)磁場(chǎng)。這種對(duì)外加磁場(chǎng)的作用稱為電子屏蔽效應(yīng)。由于電子屏蔽效應(yīng),原子核受到的磁場(chǎng)強(qiáng)度不完全等于外加磁場(chǎng)強(qiáng)度,實(shí)際上受到的磁場(chǎng)強(qiáng)度等于外加磁場(chǎng)強(qiáng)度減去次級(jí)磁場(chǎng)強(qiáng)度。在分子中處于不同化學(xué)環(huán)境的原子核,其核外電子云的分布也各不相同,因此,原子核受到的屏蔽作用也就不同。核外電子云的密度越大,屏蔽作用也就越大。若固定照射頻率,受到屏蔽作用大的核,其共振信號(hào)將出現(xiàn)在外加磁場(chǎng)較高的部位,反之亦然,這種現(xiàn)象稱為化學(xué)位移。因此,化學(xué)位移反映了原子核所處的特定化學(xué)環(huán)境?；瘜W(xué)位移能夠幫助化學(xué)家獲得關(guān)于電負(fù)性、鍵的各種異性及其他一些基本信息,對(duì)確定化合物的結(jié)構(gòu)起到了很大的作用。
由于次級(jí)磁場(chǎng)非常小,只有外加磁場(chǎng)的百萬(wàn)分之幾,化學(xué)位移的精確值很難測(cè)定。實(shí)際操作中一般都選用適當(dāng)?shù)幕衔?如四甲基硅烷——(CH3)4Si(tetramethylsilane,TMS),得出相對(duì)的化學(xué)位移值。選用四甲基硅烷是由于:它有12個(gè)等價(jià)氫,很小量的TMS即可產(chǎn)生相對(duì)強(qiáng)的單一信號(hào);由于 Si 的電負(fù)性比 C 低,屏蔽效應(yīng)強(qiáng),大部分有機(jī)分子中氫的共振吸收都出現(xiàn)在它的低場(chǎng),信號(hào)不會(huì)相互重疊;沸點(diǎn)低(27℃),測(cè)定后很容易從樣品中除去。
化學(xué)位移用 b 來(lái)表示,其定義為:
式中,ν樣和ν標(biāo)分別為樣品和 TMS 的共振頻率,Hz;ν0?為儀器所用的頻率,Hz。
化學(xué)位移的大小與外加磁場(chǎng)強(qiáng)度及相匹配的射頻成正比,所用儀器的磁場(chǎng)和頻率越高,化學(xué)位移值越大,儀器的分辨率越高。由于化學(xué)位移是用外加磁場(chǎng)的分?jǐn)?shù)來(lái)表示的,故只是與質(zhì)子化學(xué)環(huán)境有關(guān)的常數(shù)。
(5)自旋耦合與裂分
自旋量子數(shù)不為零的核在外磁場(chǎng)中會(huì)存在不同能級(jí),這些核處在不同的自旋狀態(tài),會(huì)產(chǎn)生小磁場(chǎng),產(chǎn)生的小磁場(chǎng)將與外磁場(chǎng)產(chǎn)生疊加效應(yīng),使共振信號(hào)發(fā)生分裂干擾。這種核的自旋產(chǎn)生的相互干擾稱為自旋-自旋耦合(spin-spin coupling),簡(jiǎn)稱自旋耦合。
在外磁場(chǎng)H0的作用下,自旋的質(zhì)子產(chǎn)生一個(gè)小的磁矩(磁場(chǎng)強(qiáng)度為H1),通過(guò)成鍵價(jià)電子的傳遞,對(duì)鄰近的質(zhì)子產(chǎn)生影響。質(zhì)子的自旋有兩種取向,自旋時(shí)與外磁場(chǎng)取順向排列的質(zhì)子,使受它作用的鄰近質(zhì)子感受到的總磁場(chǎng)強(qiáng)度為(H0+H1);自旋時(shí)與外磁場(chǎng)取逆向排列的質(zhì)子,使鄰近質(zhì)子感受到的總磁場(chǎng)強(qiáng)度為(H0-H1)。因此,當(dāng)發(fā)生核磁共振時(shí),一個(gè)質(zhì)子發(fā)出的信號(hào)就被鄰近的另一個(gè)質(zhì)子裂分成了兩個(gè),這就是自旋裂分。
(6)原子核的弛豫
由高能態(tài)通過(guò)非輻射途徑恢復(fù)到低能態(tài)的過(guò)程稱為弛豫。弛豫過(guò)程決定了自旋核處于高能態(tài)的壽命,而 NMR 信號(hào)峰自然寬度與其壽命直接相關(guān)。根據(jù) Heisenberg 不確定性原理,有
式中,Δτ 為自旋核高能態(tài)壽命。
自旋核總是處在周圍分子的包圍之中,一般將周圍分子統(tǒng)稱為晶格。在晶格中,核處于不斷的熱運(yùn)動(dòng)中,產(chǎn)生了一個(gè)變化的局部磁場(chǎng)。處于高能態(tài)的核可以將能量傳遞給相應(yīng)的晶格,從而完成弛豫過(guò)程,稱為自旋-晶格弛豫,其特征壽命為T1。自旋-晶格弛豫的速度隨被測(cè)物質(zhì)的熱運(yùn)動(dòng)速度的增加而加快。例如,在絕緣性較好的固體物質(zhì)中,自旋晶格弛豫難以發(fā)生,T1較大;在黏性較小的液體中,T1則較小。弛豫發(fā)生在自旋核之間,稱為自旋-自旋弛豫,其特征壽命為T2。自旋-自旋弛豫是使自旋體系內(nèi)部出現(xiàn)的不平衡狀態(tài)恢復(fù)到平衡狀態(tài),并保持系統(tǒng)內(nèi)部平衡的一種相互作用機(jī)制。
(7)傅里葉變換 NMR
傅里葉變換 NMR 譜儀又稱脈沖傅里葉變換 NMR 儀(PFT-NMR,pulse Fourier transform NMR),是一種獲取NMR 信號(hào)的儀器。在 PFT-NMR 中,不是通過(guò)掃描頻率的方法找到共振條件,而是在恒定的磁場(chǎng)中,在整個(gè)頻率范圍內(nèi)施加具有一定能量的脈沖,使自旋取向發(fā)生改變而躍遷到高能態(tài)。高能態(tài)的核經(jīng)一段時(shí)間后又重新返回到低能態(tài),通過(guò)收集這個(gè)過(guò)程產(chǎn)生的感應(yīng)電流,即可獲得時(shí)域上的波譜圖。一種化合物具有多種吸收頻率時(shí),所得的圖像將十分復(fù)雜,稱為自由感應(yīng)衰減(free induction decay,FID),其信號(hào)產(chǎn)生于激發(fā)態(tài)的弛豫過(guò)程。FID 信號(hào)經(jīng)傅里葉變換后即可獲得頻域上的波譜圖,即常見(jiàn)的 NMR 譜圖。
(8)NMR 成像
經(jīng)典力學(xué)模型認(rèn)為,對(duì)于一個(gè)具有非零自旋量子數(shù)的核,由于核帶正電荷,所以在其旋轉(zhuǎn)時(shí)會(huì)產(chǎn)生磁場(chǎng)。當(dāng)這個(gè)自旋核置于磁場(chǎng)中時(shí),核自旋產(chǎn)生的磁場(chǎng)與外加磁場(chǎng)相互作用,就會(huì)產(chǎn)生回旋,稱為進(jìn)動(dòng)。進(jìn)動(dòng)頻率與外加磁場(chǎng)的關(guān)系可以用 Larmor 方程表示,即
式中,ν 為電磁波的輻射頻率;r 為磁旋比;B 為磁感應(yīng)強(qiáng)度。
NMR 成像需要在外磁場(chǎng)上再加上一個(gè)線性磁場(chǎng)梯度,質(zhì)子進(jìn)動(dòng)頻率則與其所在位置相關(guān)。因?yàn)轭l率可以通過(guò)測(cè)量得出,并且根據(jù)已知磁場(chǎng)的空間變化,便可確定共振核的位置。典型的傅里葉成像需要使用一個(gè)與原磁場(chǎng)方向相同的磁場(chǎng)梯度,同一磁場(chǎng)梯度的點(diǎn)則成為一個(gè)曲面。信號(hào)的頻率在 X 軸方向上編碼,相位也在 Y 軸方向上編碼。在二維傅里葉轉(zhuǎn)換后,可獲得一個(gè)編碼 NMR 信息的矩陣。此矩陣經(jīng)過(guò)軟件進(jìn)行處理后,能在顯示器上顯示或打印出來(lái),便成為可視化的圖像。
