霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)方法比較與操作說明
霉菌和酵母廣泛分布于自然界并可作為食品中正常菌相的一部分。長期以來，人們利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鮮美；還可利用霉菌和酵母釀酒、制醬；食品、化學(xué)、醫(yī)藥等工業(yè)都少不了霉菌和酵母。但在某些情況下，霉菌和酵母也可造成中腐敗變質(zhì)。由于它們生長緩慢和競爭能力不強(qiáng)，故常常在不適于細(xì)菌生長的食品中出現(xiàn)，這些食品是pH低、濕度低、含鹽和含糖高的食品、低溫貯藏的食品，含有抗菌素的食品等 。由于霉菌和酵母能抵抗熱、冷凍，以及抗菌素和輻照等貯藏及保藏技術(shù)，它們能轉(zhuǎn)換某些不利于細(xì)菌的物質(zhì)，而促進(jìn)致病細(xì)菌的生長；有些霉菌能夠合成有毒代謝產(chǎn)物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鮮的和加工的食品中繁殖，可使食品發(fā)生難聞的異味，它還可以使液體發(fā)生混濁，產(chǎn)生氣泡，形成薄膜，改變顏色及散發(fā)不正常的氣味等 。因此霉菌和酵母也作為評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的指示菌，并以霉菌和酵母計(jì)數(shù)來制定食品被污染的程度。目前已有若干個(gè)國家制訂了某些食品的霉菌和酵母限量標(biāo)準(zhǔn)。我國已制訂了一些食品中霉菌和酵母的限量標(biāo)準(zhǔn)。
菌和酵母的計(jì)數(shù)方法，與菌落總數(shù)的測(cè)定方法基本相似。主要步驟為：
霉菌直接鏡檢計(jì)數(shù)法：對(duì)霉菌計(jì)數(shù)，可以采用直接鏡檢的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。
在顯微鏡下，霉菌菌絲具有如下特征：
平行壁：霉菌菌絲呈管狀，多數(shù)情況下，整個(gè)菌絲的直徑是一致的。因此在顯微鏡下菌絲壁看起來象兩條平行的線。這是區(qū)別霉菌菌絲和其他纖維時(shí)最有用的特征之一。
橫隔：許多霉菌的菌絲具有橫隔，毛霉、根霉等少數(shù)霉菌的菌絲沒有橫隔。
菌絲內(nèi)呈粒狀：薄壁、呈管狀的菌絲含有原生質(zhì)，在高倍顯微鏡下透過細(xì)胞壁可見其呈粒狀或點(diǎn)狀。
分枝：如菌絲不太短，則多數(shù)呈分枝狀，分枝與主干的直徑幾乎相同，有分枝是鑒定霉功得出可靠的特征之一。
菌絲的頂端：常呈鈍圓形。
無折射現(xiàn)象。
凡有以上特征之一的絲狀均可判定為霉菌菌絲。
觀察視野中有無菌絲，凡符合下列情況之一者為陽性視野。
一根菌絲長度超過視野直徑1/6；
一根菌絲長度加上分枝的長度超過視野直徑1/6；
兩根菌絲總長度超過視野直徑1/6；
三根菌絲總長度超過視野直徑1/6；
一叢菌絲可視為一個(gè)菌絲，所有菌絲（包括分枝）總長度超過視野直徑1/6。
根據(jù)對(duì)所有視野的觀察結(jié)果，計(jì)算陽性視野所占比例，并以陽性視野百分?jǐn)?shù)（%）報(bào)告結(jié)果。計(jì)算公式：
每件樣品陽性視野（%）=（陽性視野數(shù) / 觀察視野數(shù)）×100
將樣品制作成10倍梯度的稀釋液，選擇3個(gè)合適的稀釋度，吸取1mL于平皿，傾注培養(yǎng)基后，培養(yǎng)觀察，計(jì)數(shù)。
對(duì)霉菌的計(jì)數(shù)，還可以采用顯微鏡直接鏡檢計(jì)數(shù)的方法。
說明：
1、傾注培養(yǎng)。每個(gè)樣品應(yīng)選擇3個(gè)適宜的稀釋度，每個(gè)稀釋度傾注2個(gè)平皿。培養(yǎng)基熔化后冷卻至2、5℃，立即傾注并旋轉(zhuǎn)混勻，先向一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，再轉(zhuǎn)向相反方向，充分混合均勻。培養(yǎng)基凝固后，把平皿翻過來放溫箱培養(yǎng)。大多數(shù)霉菌和酵母在25－30℃的情況下生長良好，因此培養(yǎng)溫度3、5~28℃。培養(yǎng)3d后開始觀察菌落生長情況，共培養(yǎng)5d觀察記錄結(jié)果。
4、菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告：選取菌落數(shù)10~150之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，取兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。固體檢樣以g為單位報(bào)告，液體檢樣以mL 單位報(bào)告。關(guān)于稀釋倍數(shù)的選擇可參考細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定。
5、樣品的處理。為了準(zhǔn)確測(cè)定霉菌和酵母數(shù)，真實(shí)反映被檢食品的衛(wèi)生質(zhì)量，首先應(yīng)注意樣品的代表性。對(duì)大的固體食品樣品，要用滅菌刀或鑷子從不同部位采取試驗(yàn)材料，再混合磨碎。如樣品不太大，最好把全部樣品放到滅菌均質(zhì)器杯內(nèi)攪拌2min。液體或半固體樣品可用迅速顛倒容器25次來混勻。
6、樣品的稀釋：為了減少櫚稀釋倍數(shù)的誤差，在連續(xù)遞增稀釋時(shí)，每一稀釋度應(yīng)更換一根吸管。在稀釋過程中，為了使霉菌的孢子充分散開，需用滅菌吸管反復(fù)吹吸50次。
7、培養(yǎng)基的選擇：在霉菌和酵母計(jì)數(shù)中，主要使用以下幾種選擇性培養(yǎng)基。
馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培養(yǎng)基上生長良好。用PDA作平板計(jì)數(shù)時(shí)，必項(xiàng)加入抗菌素以抑制細(xì)菌。
孟加拉紅（虎紅）培養(yǎng)基：該培養(yǎng)基中的孟加拉紅和抗菌素具有抑制細(xì)菌的作用。孟加拉紅還可抑制霉菌菌落的蔓延生長。在菌落背面由孟加拉紅產(chǎn)生的紅色有助于霉菌和酵母菌落的計(jì)數(shù)。
高鹽察氏培養(yǎng)基：糧食和食品中常見的曲霉和青霉在該培養(yǎng)基上分離效果良好，它具有抑制細(xì)菌和減緩生長速度快的毛霉科菌種的作用。
