體積排阻色譜（SEC）：大分子分離的“分子篩”奧秘

2025-03-12

你是否好奇科學家如何精確分析多肽、蛋白質(zhì)、聚合物甚至病毒顆粒的分子量？答案就藏在**體積排阻色譜（SEC）**的奇妙世界中！今天，讓我們揭開 SEC 固定相的神秘面紗，探索它如何成為實驗室的“分子尺子”！

SEC 的核心：尺寸決定命運！

SEC 的原理簡單卻強大——大分子先出，小分子后出！固定相由多孔填料組成，分子像“賽跑選手”一樣穿過孔道：

大分子因體積過大，直接被“拒之門外”，快速洗脫（排阻體積）。

小分子能鉆進孔隙“迷宮”，洗脫時間更長（滲透體積）。

下圖所示為 SEC 色譜圖中化合物尺寸與洗脫的關(guān)系。一個常見的誤解是 SEC 基于分子量分離分子。大多數(shù)情況下確實是這樣，分子量較大的分析物通常會先洗脫。不過，更準確的說法是 SEC 基于流體力學體積分離分子，即分子在流動相或溶劑中的有效大小。

SEC 通常分為兩種不同的類型：

凝膠過濾色譜法（GFC）：使用水溶液作為流動相

凝膠滲透色譜法（GPC）：使用有機溶劑作為流動相

雖然 SEC 包括 GFC 和 GPC 兩種不同類型的分析，但大多數(shù)科學家并不對其進行區(qū)分。科學家經(jīng)常交換使用 GPC 和SEC。他們經(jīng)常會稱自己的工作為水相 GPC/SEC 或非水相 GPC/SEC，而不是 GPC 或 GFC。

固定相：硅膠 VS 聚合物，誰主沉??？

SEC 色譜柱的固定相可以是硅膠基質(zhì)或聚合物基質(zhì)。硅膠基質(zhì)色譜柱與極性基團（通常為二醇）鍵合，以防止與分析物產(chǎn)生離子相互作用。聚合物基質(zhì)色譜柱使用疏水性或極性指數(shù)與樣品相似的聚合物填料?？梢詮南卤淼恼碇邪l(fā)現(xiàn)，兩種固定相各有各的優(yōu)劣勢。

按照上述對比，我們可以大致得出一個寬泛的結(jié)論：高分辨率快速分離、以及常規(guī)分析可以優(yōu)選硅膠基質(zhì)，且緩沖液+硅膠柱的搭配更適合親水性生物分子（如蛋白）；對于極端 pH 或有機溶劑條件，以及分析超大分子（如病毒顆粒、合成高分子）的時候，聚合物基質(zhì)更優(yōu)。

實戰(zhàn)技巧：如何玩轉(zhuǎn) SEC？

SEC 填料為全多孔，通過不同孔徑進行分離。孔的體積越大，SEC 填料的分離能力越強。排阻體積（Vo）對應固定相孔排除的化合物洗脫所需的流動相體積?？倽B透體積（Vt）是尺寸足夠小、可以完全進入固定相孔的化合物洗脫所需的流動相體積?；衔锓蛛x發(fā)生在排阻體積與總滲透體積之間。這個體積用填料的總孔體積表示（參見下圖）。最終，SEC 填料的孔徑將決定色譜柱的排阻范圍，或排阻體積與滲透體積之間的對應分子量范圍。

基于上述原理，在使用 SEC 的過程中，我們可以利用以下實用攻略：

串聯(lián)色譜柱：

同孔徑串聯(lián)（如雙 50? 柱）→通過延長柱長提高理論塔板數(shù)，增強對分子量接近組分的分離分辨率。

不同孔徑串聯(lián)（如 50?+1000?）→擴展分離分子量范圍，兼顧小分子片段與大分子聚集體的同步檢測。注意需要將大孔徑柱置于前端，避免小孔徑柱堵塞風險。

選擇合適的填料孔徑：

需確保目標分子處于填料的線性分離區(qū)間（介于排阻極限與滲透極限之間），按照核心公式（經(jīng)驗法則）：

球形分子（如蛋白質(zhì)、抗體）：

孔徑（?）≈ 分子量（kDa）× 1.5

例：150 kDa 單抗 → 200-300 ?。雖然選擇 200? 和 300? 都是滿足排阻范圍的，但是 200? 可以在保證聚集體分離的前提下，帶來更好的片段分離能力，實現(xiàn)更全面的質(zhì)量監(jiān)控。

線性/柔性分子（如核酸、多糖、PEG）：

孔徑與分子量的關(guān)系通常為非線性

例：5,000 nt mRNA ≈ 1,500 kDa → 700-1,000 ?。對于 5000 nt 以下的 mRNA，選擇 700 ?（貼近計算值下限），能夠帶來更高的分辨率。

Phenomenex SEC 產(chǎn)品亮點

Biozen dSEC-2 & dSEC-7：通過生物惰性系統(tǒng)與親水化硅膠填料的協(xié)同設計，為生物藥關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）分析提供更靈敏、更穩(wěn)定的分離平臺。

Yarra & Biosep：硅膠柱中的“性價比之王”，專為多肽，蛋白質(zhì)分離而生。

Polysep：聚合物基質(zhì)搭配 GFC 分析，輕松應對多糖等復雜樣本。

Phenogel：聚合物柱的“多面手”，覆蓋從 PS（聚苯乙烯）到 PEG（聚乙二醇）的全場景 GPC 需求。

未來展望

隨著生物藥與復雜制劑（mRNA/AAV/ADC）的爆發(fā)式增長，高通量、高精度 SEC 平臺已成為研發(fā)質(zhì)控的核心剛需。Phenomenex SEC 色譜技術(shù)持續(xù)賦能，為生物醫(yī)藥“關(guān)鍵質(zhì)量屬性”提供更優(yōu)異的分離保障！