Kinetex配合ZenoTOF 7600實(shí)現(xiàn)全新糖肽分析方法，助力乳腺癌生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)

2025-02-21

復(fù)旦大學(xué)喬亮教授團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合浙江大學(xué)杭州國際科創(chuàng)中心楊奕博士、SCIEX公司和BSI公司的科學(xué)家，基于ZenoTOF 7600儀器開發(fā)了完整糖肽定量分析新方法，并將其應(yīng)用于癌癥糖肽生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，確定了15種位點(diǎn)特異性糖鏈作為檢測乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物。相關(guān)工作發(fā)表在分析化學(xué)領(lǐng)域著名期刊《Analytical Chemistry》上。

前言

在生物醫(yī)學(xué)的核心研究領(lǐng)域中，尋找可靠的疾病診斷標(biāo)志物始終是備受矚目的熱門課題。蛋白質(zhì)糖基化作為一種關(guān)鍵的翻譯后修飾，深度參與生物功能的精細(xì)調(diào)控進(jìn)程，在眾多生命活動中發(fā)揮著不可或缺的作用。異常糖基化與包括乳腺癌在內(nèi)的多種疾病緊密相連，因此成為疾病生物標(biāo)志物研究的重點(diǎn)方向。然而，由于糖基化在位點(diǎn)及糖鏈結(jié)構(gòu)上的高度異質(zhì)性，對其進(jìn)行全面精準(zhǔn)分析極具挑戰(zhàn)。

質(zhì)譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)完整糖肽的全面精準(zhǔn)表征，已成為糖蛋白組學(xué)分析及生物標(biāo)志物篩選的通用工具。本研究使用 ZenoTOF 7600 高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，針對 124 例涵蓋乳腺癌、非癌性疾病及非疾病對照的臨床血清樣本進(jìn)行分析，充分利用該系統(tǒng)獨(dú)特的 Zeno 阱對碎片離子的高效捕獲及精準(zhǔn)釋放功能，極大地提升了質(zhì)譜分析的靈敏度與準(zhǔn)確性，為糖蛋白組學(xué)研究提供全新視角，充分展現(xiàn)了大規(guī)模糖蛋白質(zhì)組分析的能力，為乳腺癌的早期診斷提供支持。

研究方法

1．樣本收集及處理

研究團(tuán)隊(duì)收集了 40 例乳腺惡性腫瘤（MT）患者、43 例乳腺良性病變（BL）患者和 41 例健康對照（Con）志愿者的 124 份臨床血清樣本。樣本采集嚴(yán)格遵循倫理規(guī)范，在未進(jìn)行任何治療干預(yù)前完成，并獲得受試者書面知情同意。對血清樣本中的蛋白質(zhì)依次進(jìn)行尿素變性、還原、烷基化、胰蛋白酶酶切及脫鹽處理，隨后采用親水作用色譜填料（Hilic) 富集糖肽。

2. 質(zhì)譜分析及參數(shù)優(yōu)化

樣品前處理完成后使用phenomenex的Kinetex XB-C18 (0.3*150mm*2.6um) 配合ZenoTOF 7600 質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，研究人員針對碰撞誘導(dǎo)解離（CID）參數(shù)進(jìn)行深度優(yōu)化，以混合人血清樣本為研究對象，設(shè)置 20 - 100 范圍內(nèi)的 9 個(gè)固定碰撞能量（CE）及動態(tài) CE 進(jìn)行分析(圖1a)。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)對比發(fā)現(xiàn)，動態(tài) CE在鑒定糖肽數(shù)量及位點(diǎn)特異性糖鏈鑒定方面展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，相較于多數(shù)固定 CE 條件，動態(tài) CE 能夠顯著提升鑒定效率，同時(shí)兼顧糖鏈與肽段鑒定效果，為復(fù)雜糖蛋白組的深度分析提供了更為優(yōu)化的參數(shù)選擇（圖1b）。

圖1.不同碎裂條件對完整糖肽鑒定的性能比較

乳腺癌糖蛋白組學(xué)分析結(jié)果

1. 乳腺癌血清糖蛋白組多樣性分析

本研究對 124 名女性參與者的血清樣本展開分析，其中涵蓋 40 例乳腺惡性腫瘤（MT）患者、43 例乳腺良性病變（BL）患者以及 41 例無乳腺疾病的對照（Con）樣本。針對每個(gè)樣本，均進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白組學(xué)分析（圖2a）。在蛋白質(zhì)組層面，共鑒定出 1188 種蛋白質(zhì)，其中高達(dá)97%的蛋白質(zhì) 在 MT、BL和 Con 組中均被鑒定到，表明蛋白質(zhì)組在不同樣本間具有較高相似性。糖蛋白組學(xué)分析結(jié)果顯示出更為豐富的多樣性，MT、BL 和 Con 組分別鑒定出 3531、5321 和 3963 種位點(diǎn)特異性糖鏈，分別對應(yīng) 492、610 和 494 個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中有 2318 種位點(diǎn)特異性糖鏈和 333 個(gè)糖基化位點(diǎn)在三組樣本中共同存在（圖2b）。從糖基化位點(diǎn)連接糖鏈數(shù)量分布來看，32% - 37% 的糖基化位點(diǎn)包含三種以上糖鏈，22% - 24% 包含兩至三種糖鏈，而40% - 44% 僅含有一種糖鏈（圖 2c）。MT 和 BL 組中不同類型位點(diǎn)特異性糖鏈的總體比例與 Con 組相當(dāng)（圖2d）。

圖2. 臨床血清樣本的糖蛋白組分析

2. 糖蛋白組定量差異分析

基于無標(biāo)記定量（LFQ）技術(shù)對糖蛋白組進(jìn)行定量分析，并結(jié)合主成分分析（PCA）、火山圖、層次聚類及功能富集分析等多元方法深入挖掘數(shù)據(jù)。PCA 結(jié)果顯示，利用位點(diǎn)特異性糖鏈進(jìn)行分析時(shí)，MT、BL 和 Con 組在前三個(gè)主成分中呈現(xiàn)明顯分離趨勢，而蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)未展現(xiàn)出顯著差異(圖3a）。三維火山圖分析表明，多數(shù)位點(diǎn)特異性糖鏈在 MT 和 BL共同上調(diào)（345 種）或僅在 MT 中上調(diào)（230 種），BL（162 種）或 Con（126 種）單獨(dú)上調(diào)數(shù)量相對較少(圖3b)。對位點(diǎn)特異性糖鏈定量結(jié)果進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn) MT樣本緊密聚集形成一個(gè)獨(dú)特集群，BL 樣本呈現(xiàn)出明顯的分化趨勢，而 Con 樣本則自成一群，與 MT和 BL界限分明(圖3c)。相比之下，運(yùn)用相同統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)對蛋白質(zhì)組結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)少量差異表達(dá)蛋白質(zhì)，且三組樣本聚類效果欠佳。這一鮮明對比充分表明，血清糖蛋白組分析蘊(yùn)含著更為豐富的信息，相較于血清蛋白質(zhì)組在乳腺癌診斷領(lǐng)域具有更顯著的優(yōu)勢。對差異糖修飾進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)其對應(yīng)的糖蛋白主要涉及凝血、糖胺聚糖結(jié)合、肽酶活性、免疫反應(yīng)等關(guān)鍵生物學(xué)過程及膽固醇代謝等重要代謝通路，為乳腺癌發(fā)病機(jī)制研究提供重要線索(圖3d)。

圖3. 乳腺疾病血清糖蛋白組定量分析

3. 乳腺癌糖標(biāo)志物篩選與驗(yàn)證

為篩選乳腺癌診斷生物標(biāo)志物，研究采用隨機(jī)森林模型，將樣本集隨機(jī)分為建模子集（包含 25 例 MT 樣本、28 例 BL 樣本和 26 例 Con 樣本）和驗(yàn)證子集（每組各 15 例樣本）（圖4a），經(jīng)蒙特卡洛交叉驗(yàn)證（MCCV）篩選出 15 種位點(diǎn)特異性糖鏈（圖4b）。該模型在建模子集和驗(yàn)證子集上均表現(xiàn)出高準(zhǔn)確性，ROC曲線下面積（AUC）值分別達(dá) 0.98 和 0.99（圖4c）。對 15 種候選糖修飾標(biāo)志物在 MT 和 Con樣本上進(jìn)行了靶向 MS/MS 分析，有13 種糖肽能夠被檢測和定量，且有 10 種糖肽在 MT組中豐度更高，其中有6 種糖肽的豐度變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，這些位點(diǎn)特異性糖鏈可被視為潛在的乳腺癌診斷生物標(biāo)志物。

圖4. 用于乳腺癌癥診斷的位點(diǎn)特異性寡聚糖生物標(biāo)志物篩選

總結(jié)

本研究開發(fā)了基于 ZenoTOF 7600的完整糖肽表征方法，并展示了其在大規(guī)模臨床血清樣本糖蛋白質(zhì)組定量分析中的應(yīng)用。本研究篩選出的 15 種位點(diǎn)特異性糖鏈有望成為潛在的乳腺癌診斷生物標(biāo)志物。未來，該方法有望在基礎(chǔ)和臨床糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮更大作用，為腫瘤精準(zhǔn)診斷和治療提供有力支持。

參考文獻(xiàn)

1. Yang, Y., Zhao, D., Luo, J., Lin, L., Lin, Y., Shan, B., Chen, H., Qiao, L., Quantitative site-specific glycoproteomics reveals glyco-signatures for breast cancer diagnosis. Analytical Chemistry 2025, 97 (1): 114-121.

2. 全文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c03069