新品丨Durashell氨基酸衍生分析方法包——多肽藥物氨基酸比值分析

2024-12-20

氨基酸分析是生命科學(xué)研究中最重要的技術(shù)之一。氨基酸是人體蛋白質(zhì)的基本組成物質(zhì)，除個(gè)別芳香族氨基酸外，紫外吸收均較弱，直接使用紫外檢測(cè)器檢測(cè)靈敏度低。故氨基酸分析通常需要選擇合適的衍生試劑增加氨基酸的生色團(tuán)，再使用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。目前氨基酸衍生主要包括柱前和柱后衍生兩種方法。

游離氨基酸的測(cè)定方法主要有柱前衍生反相色譜法、柱后衍生離子交換色譜法、離子色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法、液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法、柱前衍生氣相色譜法、衍生化毛細(xì)管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、超臨界流體色譜法等，其中柱前衍生反相色譜法和柱后衍生離子交換色譜法為藥品中氨基酸測(cè)定常用方法。

艾杰爾公司推出的 Durashell AA 氨基酸分析方法是基于目前廣泛使用的以 OPA（鄰苯二醛）和 FMOC（9- 芴基甲基氯甲酸鹽）為衍生劑的柱前衍生 HPLC 氨基酸分析方法。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、無需要手工衍生，可全自動(dòng)化在線分析、衍生試劑無毒等優(yōu)點(diǎn)，通過液相進(jìn)樣器自動(dòng)衍生程序的設(shè)置，大大減少研究人員在衍生過程中的操作步驟及誤差。

圖 1. OPA 在巰基試劑存在下與一級(jí)氨基酸的衍生反應(yīng)圖

圖 2. FMOC 與二級(jí)氨基酸的衍生反應(yīng)圖

同時(shí)，氨基酸分析也常用于測(cè)定蛋白質(zhì)、多肽及其他藥物制劑中氨基酸組成或含量。多肽作為由多個(gè)氨基酸通過肽鍵連接而形成的一類化合物，通常由 10~100 個(gè)氨基酸分子組成，連接方式與蛋白質(zhì)相同，相對(duì)分子質(zhì)量一般低于 10000。根據(jù) 2023 年 CDE 發(fā)布的《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，在合成多肽原料藥的質(zhì)控考察項(xiàng)目中，氨基酸分析數(shù)據(jù)可用于計(jì)算多肽藥物的氨基酸比值。氨基酸分析的水解方法可參考相關(guān)技術(shù)指南進(jìn)行（例如《中華人民共和國(guó)藥典》（2020 年版）第一增補(bǔ)本（四部）中新增“9120 氨基酸分析指導(dǎo)原則”）。

蛋白質(zhì)或多肽樣品中的氨基酸是以結(jié)合形式存在，必須經(jīng)過水解處理，形成游離氨基酸后才能進(jìn)行氨基酸測(cè)定。蛋白質(zhì)或多肽的水解方法主要采用酸水解，同時(shí)輔以堿水解。其中，酸水解中使用最廣泛的是鹽酸水解，所得其產(chǎn)生的氨基酸不消旋，但該方法引起會(huì)使一些氨基酸的被全部破壞或部分破壞，如色氨酸被全部破壞，絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸被部分破壞，門冬酰胺和谷氨酰胺脫酰胺分別轉(zhuǎn)化為門冬氨酸和谷氨酸。對(duì)于這些氨基酸可采用較特殊的處理方法或者使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的形式，然后再進(jìn)行鹽酸水解。

以利那洛肽為例，在水解過程中加入二硫代二丙酸（DTDPA）以保護(hù)半胱氨酸，考察了酸性水解條件下各氨基酸的比值情況。

液相色譜分析

色譜柱：Durashell AA, 4.6*150 mm; 3 μm; 100 ?

柱溫：45 ℃

波長(zhǎng)：

一級(jí)氨基酸: 338 nm, 帶寬 10 nm; 參比波長(zhǎng): 390 nm, 帶寬 20 nm

二級(jí)氨基酸: 262 nm, 帶寬 16 nm, 參比波長(zhǎng): 324 nm, 帶寬 8 nm

狹縫：4 nm, 峰寬＞0.03 min

梯度洗脫程序：

時(shí)間/min	流動(dòng)相 A%	流動(dòng)相 B%	流速 mL/min
0	94	6	1.6
6	90	10	1.6
8	90	10	1.6
10	84	16	1.3
23	60	40	1.0
30	50	50	1.6
31	0	100	1.6
34	0	100	1.6
35	94	6	1.6
38	94	6	1.6

安捷倫進(jìn)樣器自動(dòng)衍生程序

序號(hào)	進(jìn)樣器程序	衍生用試劑的分裝與放置位置
1	從 1 號(hào)瓶中吸取硼酸鹽緩沖液 5 μL	往 2 mL 進(jìn)樣瓶中加入 1 mL 硼酸鹽緩沖液，加帶密封墊的螺旋蓋，密封，置于進(jìn)樣器樣品架的 1 號(hào)位置
2	從樣品瓶中吸取樣品 2 μL	衍生用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液置于進(jìn)樣器樣品架的 8-100 號(hào)位置
3	在空氣中以最大的速度混合 7 μL，6 次
4	等待 0.5 分鐘
5	從 2 號(hào)瓶中吸取水 0 μL	向 2 mL 樣品瓶中加入 2 mL 水，加不帶密封墊的螺旋蓋，置于進(jìn)樣器樣品架的 2 號(hào)位置
6	從 3 號(hào)瓶中吸取 OPA 衍生劑 1 μL	向帶內(nèi)插管的棕色樣品瓶中加入 200 μL OPA 衍生試劑，加帶密封墊的螺旋蓋，密封，置于進(jìn)樣器樣品架的 3 號(hào)位置
7	在空氣中以最大的速度混合 8 μL，6 次
8	從 6 號(hào)瓶中吸取水 0 μL	向 2 mL 樣品瓶中加入 2 mL 水，加不帶密封墊的螺旋蓋，置于進(jìn)樣器樣品架的 6 號(hào)位置
9	從 4 號(hào)瓶中吸取 FMOC 衍生劑 1 μL	向帶內(nèi)插管的棕色樣品瓶中加入 200 μL FMOC 衍生試劑，加帶密封墊的螺旋蓋，密封，置于進(jìn)樣器樣品架的 4 號(hào)位置
10	在空氣中以最大的速度混合 9 μL，10 次
11	從 7 號(hào)瓶中吸取 50 % 乙腈溶液 0 μL	向 2 mL 樣品瓶中加入 50% 乙腈溶液 2 mL，加不帶密封墊的螺旋蓋，置于進(jìn)樣器樣品架的 7 號(hào)位置
12	從 5 號(hào)瓶中吸取稀釋劑 32 μL	向 2 mL 樣品瓶中加入稀釋劑 2 mL，加帶密封墊的螺旋蓋，密封，置于進(jìn)樣器樣品架的 5 號(hào)位置
13	在空氣中以最大的速度混合 41 μL，8 次
14	進(jìn)樣

輔助：

吸液速度：200 μL/min

噴液速度：600 μL/min

吸液位置：0.0 mm

注意：如果一次測(cè)定樣品數(shù)較多，需長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)分析，建議按樣品運(yùn)行次數(shù)及時(shí)更換 5 號(hào)瓶中的稀釋劑及 2、6、7 號(hào)瓶中清洗進(jìn)樣針外壁的溶劑。

表 1. 混合氨基酸對(duì)照溶液保留時(shí)間

氨基酸名稱	英文縮寫	保留時(shí)間/min
門冬氨酸	Asp	1.269
谷氨酸	Glu	1.695
絲氨酸	Ser	4.989
組氨酸	His	6.885
甘氨酸	Gly	7.814
蘇氨酸	Thr	8.546
半胱氨酸	Cys-X	9.613
精氨酸	Arg	11.563
丙氨酸	Ala	12.775
酪氨酸	Tyr	15.633
纈氨酸	Val	19.574
甲硫氨酸	Met	19.918
正纈氨酸	Nva（內(nèi)標(biāo)）	20.695
苯丙氨酸	Phe	22.470
異亮氨酸	Ile	22.966
亮氨酸	Leu	24.202
賴氨酸	Lys	24.703
肌氨酸	Sar（內(nèi)標(biāo)）	29.484
脯氨酸	Pro	30.518

圖 3. 混合氨基酸對(duì)照溶水解液相色譜圖（一級(jí)氨基酸）

圖 4. 混合氨基酸對(duì)照溶液水解液相色譜圖（二級(jí)氨基酸）

圖 5. 利那洛肽水解溶液液相色譜圖（一級(jí)氨基酸）

圖 6. 利那洛肽水解溶液液相色譜圖（二級(jí)氨基酸）

表 2. 利那洛肽樣品溶液 110 ℃ 下水解測(cè)試數(shù)據(jù)

氨基酸比值
氨基酸名稱	英文縮寫	測(cè)試值	要求范圍
門冬氨酸	Asp	1.06	0.85-1.15
谷氨酸	Glu	1.00	0.85-1.15
甘氨酸	Gly	1.00	0.85-1.15
蘇氨酸	Thr	0.99	0.85-1.15
半胱氨酸	Cys-X	5.85	5.1-6.9
丙氨酸	Ala	0.94	0.85-1.15
酪氨酸	Tyr	1.66	1.7-2.3
正纈氨酸	Nva（內(nèi)標(biāo)）
肌氨酸	Sar（內(nèi)標(biāo)）
脯氨酸	Pro	0.95	0.85-1.15

表 3. 利那洛肽樣品溶液 150 ℃ 下水解測(cè)試數(shù)據(jù)

氨基酸比值
氨基酸名稱	英文縮寫	測(cè)試值	要求范圍
門冬氨酸	Asp	1.02	0.85-1.15
谷氨酸	Glu	0.98	0.85-1.15
甘氨酸	Gly	1.00	0.85-1.15
蘇氨酸	Thr	0.98	0.85-1.15
半胱氨酸	Cys-X	6.28	5.1-6.9
丙氨酸	Ala	0.99	0.85-1.15
酪氨酸	Tyr	1.89	1.7-2.3
正纈氨酸	Nva（內(nèi)標(biāo)）
肌氨酸	Sar（內(nèi)標(biāo)）
脯氨酸	Pro	1.07	0.85-1.15

結(jié)果表明，利那洛肽經(jīng)酸性水解后進(jìn)行各氨基酸比值分析與理論值相符，該方法可作為多肽類藥物水解后經(jīng)衍生檢測(cè)氨基酸比值的手段，同時(shí)，建議根據(jù)不同多肽氨基酸組成優(yōu)化水解溫度、時(shí)長(zhǎng)及巰基保護(hù)試劑以獲得更好結(jié)果。完整應(yīng)用報(bào)告請(qǐng)掃描下方二維碼獲取。

【應(yīng)用報(bào)告】

利那洛肽與醋酸奧曲肽中氨基酸的分析方法

【說明書】

Durashell氨基酸分析方法試劑包使用說明

Durashell 氨基酸分析方法試劑包中，含有以下各組件：

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品描述	數(shù)量
DAA-Kit	Durashell 氨基酸分析方法試劑包	包含 DAA-P1，DAA-OA4，DAA-OB2，DAA-F4，DAA-SS172，DAA- SS021
DAA-P	DAA 緩沖液	硼酸緩沖液，10 mL/瓶	1 瓶
DAA-OA	DAA OPA 衍生試劑 A 液	鄰苯二甲醛，0.6 mL/瓶	4 瓶
DAA-OB	DAA OPA 衍生試劑 B 液	3- 巰基丙酸，0.3 mL/瓶	2 瓶
DAA-F	DAA FMOC 衍生試劑	氯甲酸 -9- 芴基甲酯，0.6 mL/瓶	4 瓶
DAA-SS17	DAA 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（含 17 種氨基酸）	L- 門冬氨酸、L- 谷氨酸、L- 絲氨酸、甘氨酸、L- 組氨酸、L- 精氨酸、L- 蘇氨酸、L- 丙氨酸、L- 脯氨酸、L- 酪氨酸、L- 纈氨酸、L- 甲硫氨酸、L- 異亮氨酸、L- 亮氨酸、L- 苯丙氨酸、L- 賴氨酸濃度為 2.5 μmol/mL，L- 胱氨酸濃度為 1.25 μmol/mL，溶于 0.1 mol/L HCl 溶液，1 mL/瓶	2 瓶
DAA-SS02	DAA 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（含 2 種氨基酸）	正纈氨酸，肌氨酸濃度為 0.5 mg/mL，溶于 0.1 mol/L HCl 溶液，10 mL/瓶	1 瓶

另外，方法包外可選試劑產(chǎn)品：

貨號(hào)	產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品描述
DAA-SS01-Trp	DAA 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 -Trp	色氨酸，100 mg
DAA-SS01-Hyp	DAA 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 -Hyp	羥脯氨酸，100 mg