技術(shù)速遞丨使用Biozen色譜柱評估包括聚集和衣殼負載在內(nèi)的AAV關鍵質(zhì)量屬性

2024-11-26

概述

腺相關病毒載體（AAV）用于遞送治療性基因。它們由約 3.7 Mda 的蛋白質(zhì)衣殼組成，包含最多約 5 千堿基的基因組。我們對AAV的幾個關鍵質(zhì)量屬性（CQA）進行了評估，包括DNA和蛋白質(zhì)組分。聚集是需要控制的CQA之一，因為AAV容易聚集，并且受凍融的影響很大。此外，另一個重要因素是空殼比的存在，它們被認為是雜質(zhì)，會對治療產(chǎn)品的療效和安全性產(chǎn)生不利影響。因此，準確評估完整/空殼比對保證產(chǎn)品質(zhì)量至關重要。

通常情況下，人們使用分析超速離心法來測定 AAV 的完整/空殼比。該技術(shù)具有可重現(xiàn)性，但需要大量樣品，且在GMP環(huán)境下實施具有挑戰(zhàn)性。另一種選擇是尺寸排除色譜法與多角度光散射（SEC-MALS）相結(jié)合。SEC-MALS 具有幾個優(yōu)點，包括無需樣品制備，從而顯著提高了通量。此外，基因組和衣殼的摩爾質(zhì)量信息，以及它們的顆粒濃度，都可以與完整/空殼比一起確定。在本應用中，我們強調(diào)了 Biozen dSEC-7 色譜柱除了能夠可靠地從兩種 AAV 血清型中分離單體和聚集體，還可以結(jié)合 SEC-MALS，準確測定樣品中的衣殼和 DNA 摩爾質(zhì)量、顆粒濃度以及完整 AAV 百分比。

色譜條件

色譜柱：Biozen 3 μm dSEC-7

規(guī)格：300 x 4.6 mm

貨號：00H-4789-E0

流動相：20 mM 磷酸鹽緩沖液 + 350 mM 氯化鉀 pH 6.6

流速：0.35 mL/min (Isocratic)

進樣量：25 μL

溫度：25 ℃

LC 系統(tǒng)：Agilent^? 1260 Infinity II Bio-Inert LC System

檢測器：MALS, RI, and UV @ 260 nm, 280 nm

AAV5 血清型的總摩爾質(zhì)量，以及結(jié)合蛋白質(zhì)和基因組在其中的占比，被確定為 4.69 MDa（圖 1）。在 260 和 280 nm 波長下，測定蛋白質(zhì)衣殼和 DNA 的消光系數(shù)。實驗測定值與理論值接近，表明 AAV5 樣品的組裝是正確的（表 1）。根據(jù)這些值，計算出 AAV5 血清型樣品的完整/空殼比為 0.94，表明分析樣品的衣殼填充率為 94%。與 AAV5 樣品中觀察到的現(xiàn)象類似，AAV8 樣品的聚集體和單體也能夠被很好的分離（圖 2）。經(jīng)過評估和測定后，總摩爾質(zhì)量以及結(jié)合蛋白質(zhì)和 DNA 摩爾質(zhì)量的占比，被確定為 4.53 MDa。測定了該樣品的兩個消光系數(shù)，實驗值與理論值相當（表 2）。AAV8 樣品的完整/空殼比為 0.82，表明該樣品的衣殼填充率為 82%。

分析物	總分子量（MDa）	衣殼分子量（MDa）	核酸分子量（MDa）	總（粒子/mL）	完整/空衣殼比
AAV5-Empty	3.85	3.85	-	1.82E+13	-
AAV5-CMV-GFP	4.69	3.75	0.95	1.38E+13	0.94

圖 1. AAV5 空衣殼（上）和完整衣殼（下）的摩爾質(zhì)量測定

表 1. AAV5 在 260 nm 和 280 nm 波長下的消光系數(shù)比較

波長	蛋白質(zhì)消光系數(shù)		DNA 消光系數(shù)
波長	理論	實驗	理論	實驗
260 nm	1.30	1.26	24.00	23.51
280 nm	2.10	2.15	14.60	14.08

分析物	總分子量（MDa）	衣殼分子量（MDa）	核酸分子量（MDa）	總（粒子/mL）	完整/空衣殼比
AAV8-Empty	3.94	3.94	-	2.25E+13	-
AAV8-CMV-GFP	4.53	3.72	0.81	9.69E+13	0.82