Protac——過往皆是序章

2024-10-17

人體內(nèi)約有 2 萬個蛋白質(zhì)編碼基因，現(xiàn)有研究顯示其中約有 10% 的蛋白和疾病發(fā)生有關(guān)，即約有 2000 個潛在靶點。然而根據(jù) 2017 年 NRDD 綜述的統(tǒng)計，彼時 FDA 批準的 1578 個藥物僅僅靶向了 667 種靶蛋白，其中小分子藥物靶向了 549 種，大分子藥物靶向了 146 種，僅占潛在靶點的 1/3。大量潛在靶點受限于小分子藥物的局限性難以開發(fā)藥物?；蛟S我們可以借用期刊《Nature Reviews Drug Discovery》2022 年刊載的題為“PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue”的文獻綜述來一窺未來藥物發(fā)展新篇章。

小分子靶向藥物發(fā)展：從抑制到降解

小分子藥物開發(fā)通常聚焦于篩選高親和力的抑制劑。小分子抑制劑可通過與靶向蛋白的活性位點或變構(gòu)位點緊密結(jié)合，需要持續(xù)占據(jù)該位點以阻斷其功能，從而達到治療效果，這是一種“占位驅(qū)動”（Occupancy-driven pharmacology）的作用模式。因此，傳統(tǒng)小分子靶向藥物具有以下特點：

需以高親和力持續(xù)占據(jù)蛋白的活性位點

需足夠高的藥物劑量使靶點飽和

需半衰期足夠長能持續(xù)抑制

“占位驅(qū)動”模式要求靶蛋白上具有可被小分子“占據(jù)”的明確“活性口袋”，而在已被解析的疾病相關(guān)蛋白中有高達 80% 的蛋白表面相對平滑，小分子難以穩(wěn)定結(jié)合導致小分子抑制劑的效果不甚理想，這些靶蛋白通常也被稱為難以成藥的靶點。

另一方面，人體內(nèi)存在天然蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體系統(tǒng)，其主要作用是維持細胞內(nèi)的蛋白穩(wěn)態(tài)，包括調(diào)節(jié)蛋白的數(shù)量以及異常蛋白的消除，因而靶向蛋白降解（Targeted protein degradation, TPD）技術(shù)成為近年藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域一種極具前景的策略。其中，約有 80% 的蛋白由泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）完成降解。

泛素－蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system, UPS）

泛素－蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system, UPS）是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與細胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)的降解。UPS 由泛素（ubiquitin, Ub）、泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme, E1）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzyme, E2）、泛素連接酶（ubiquitin ligase, E3）、26S 蛋白酶體及底物蛋白構(gòu)成。泛素是一個由 76 個氨基酸組成的多肽，廣泛存在于各類真核細胞中。泛素經(jīng) E1 的活化后可和 E2 結(jié)合，隨后在 E3 的催化下和底物蛋白上的一個賴氨酸殘基結(jié)合，帶上泛素標簽的底物蛋白隨后被 26S 蛋白酶體識別并降解。

E3 連接酶需要識別降解的蛋白并將泛素連接到該蛋白上，是 UPS 的關(guān)鍵因素，人體中約有 600 種 E3 連接酶，按照催化機制的不同可分為 RING、HECT、RBR 三大類：RING 可將和 E2 結(jié)合的泛素直接轉(zhuǎn)移到底物上，而 HECT 和 RBR 先將泛素轉(zhuǎn)移到自身上作為過渡，再將自身上的泛素轉(zhuǎn)移到底物上。從數(shù)量來看，RING 類 E3 連接酶超過 500 種，而 HECT 和 RBR 類僅分別有 28 種和 14 種。

圖 1. 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和 E3 泛素連接酶分類 ( a. 蛋白經(jīng) UPS降解示意圖 b. 三種 E3 連接酶類型 c. RING 類 E3 連接酶 ) ^[2]

PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera, 蛋白靶向降解嵌合體）

圖 2. 靶向蛋白降解中不同結(jié)合模式對比（a. 通過 protac 分子將靶蛋白與 E3 泛素連接酶 CRBN 結(jié)合 b. 分子膠類免疫調(diào)節(jié)劑（immunomodulatory drug,IMiDs））^[3]

目前，靶向蛋白降解劑可分為 PROTAC（Proteolysis Targeting Chimera）分子和分子膠（Molecular glue）兩大類。

上世紀 90 年代初，哈佛大學的化學生物學家斯圖爾特·施賴伯（Stuart Schreiber）團隊發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素 A 具有類似“膠水”的功能，將親環(huán)素與鈣調(diào)節(jié)神經(jīng)磷酸酶這兩種蛋白相結(jié)合，進而提出了“分子膠”的概念。分子膠通常為單價小分子（分子量小于 500Da），其具體作用機制為改變 E3 連接酶表面，從而阻斷 E3 連接酶與天然底物的結(jié)合，誘導待降解的特定蛋白結(jié)合于 E3 連接酶，進一步促進特定蛋白的泛素化修飾，最后使其被蛋白酶體降解。其代表藥物包括沙利度胺、來那度胺和泊馬度胺等免疫調(diào)節(jié)劑（immunomodulatory drug, IMiDs），已在多發(fā)性骨髓瘤等疾病治療中取得顯著效果。

以沙利度胺（商品名“反應(yīng)?！保槔?，上世紀六十年代，沙利度胺因具有鎮(zhèn)靜催眠作用且能有效抑制孕婦晨吐，而被作為新型鎮(zhèn)靜催眠類非處方藥在德國獲批上市。隨后，由于母親在孕期過度服用沙利度胺而導致胎兒“海豹樣肢體畸形”，引發(fā)了二十世紀最為著名的藥害事件——“反應(yīng)停事件”，這也是全球藥物警戒史上的里程碑事件。隨后，沙利度胺被發(fā)現(xiàn)對多種難治性疾病都具有較好的療效，但其藥理作用機制并不明確。直到后來科學家發(fā)現(xiàn)沙利度胺分子部分結(jié)構(gòu)能夠與 CRBN（E3 泛素連接酶）相互作用，另一部分能夠連接至 IKZF1/3 蛋白，從而誘導該兩種蛋白靠近，隨后 CRBN 泛素化 IKZF1/3，導致 IKZF1/3 被蛋白酶體降解，繼而調(diào)降下游 MYC/SALL4/IRF4/TNF-α 等蛋白的表達，從而發(fā)揮抗血管生成、抑制細胞增殖、抗炎癥反應(yīng)等作用。

圖 3. 基于 UPS 的 PROTAC 的作用機制^[1]

PROTAC 分子則由三部分構(gòu)成：E3 泛素連接酶配體、靶蛋白配體及 Linker；E3 泛素連接酶配體負責特異性招募 E3 泛素連接酶；靶蛋白配體用于靶向和捕獲目標蛋白。因此，PROTAC 分子能夠?qū)?E3 泛素連接酶募集到靶蛋白附近，為靶點蛋白貼上泛素標簽。而在細胞中打上泛素標簽的蛋白將被送入蛋白酶體進行降解。這樣 PROTAC 分子就能夠特異性地促進致病蛋白的降解。

傳統(tǒng)抑制劑的“占位驅(qū)動”，需要足夠大的藥物劑量使靶點飽和；足夠長的半衰期保證持續(xù)抑制；足夠高的親和力能競爭過原底物。隨之也會帶來諸多問題，如高劑量帶來的毒副作用過大；高親和力容易導致脫靶毒性及耐藥性。相較于小分子靶向抑制劑“占位驅(qū)動”的模式，PROTAC 發(fā)揮作用不需與靶蛋白緊密結(jié)合，主要取決于 E3 連接酶和靶蛋白的相互靠近（事件驅(qū)動，Event-driven pharmacology）。藥物無需直接抑制目標蛋白的功能活性，也無需與目標蛋白長時間和高強度的結(jié)合；理論上只要靶蛋白上有裂縫、缺口等可以提供短暫“著力點”即可，可以破壞蛋白質(zhì)的酶和非酶功能（例如支架）或轉(zhuǎn)錄功能，而不是單單抑制蛋白的活性，可以克服傳統(tǒng)小分子的耐藥性。并且 PROTAC 引發(fā)靶蛋白降解后即可從復合物中解離，理論上可以循環(huán)使用。

表 1. PROTACs 與分子膠降解劑 (Molecular Glue Degrader, MGDs) 參數(shù)對比^[5]

目前，在人類基因組約 600 個 E3 泛素連接酶中，只有不到 10 個被開發(fā)用于靶向蛋白質(zhì)降解，已公布的 PROTAC 分子中又以靶向 CRBN E3 泛素連接酶為主；而CRBN也成為了藥物發(fā)現(xiàn)科學家最熱衷于設(shè)計相關(guān)藥物結(jié)構(gòu)的研究方向，這很大程度源于以下因素：（a）在人體組織中廣泛表達，（b）明確的作用機制，（c）明確證明的臨床療效，（d）靶向 CRBN 的化合物具有低分子量，類藥性等特點。

表 2. 常用 E3 連接酶配體及其參數(shù)^[5]

在 FDA 批準的相關(guān)藥物中，沙利度胺 (Thalidomide)，來那度胺 (Lenalidomide) ，泊馬度胺 (Pomalidomide) 以及試驗藥物伊伯多胺 (Iberdomide, CC-220) 或 CC-8859，這類藥物均具有基于結(jié)合 CRBN 的異吲哚啉酮或鄰苯二甲酰亞胺結(jié)構(gòu)，唯一例外的是具有喹唑啉酮結(jié)構(gòu)的試驗藥物 Avadomide。這三類傳統(tǒng)的結(jié)合 CRBN 的結(jié)構(gòu)不僅可以用來直接設(shè)計相關(guān)治療藥物，如今更被用來作為 Protac 藥物中招募 E3 泛素連接酶的配體結(jié)構(gòu)，已報導的藥物包括在臨床試驗中的 ARV-471，ARV-110 和 NX-2127。

圖 4. 傳統(tǒng)靶向 CRBN 藥物及試驗藥物^[4]

如今，越來越多的研究人員正參與到 Protac 藥物的結(jié)構(gòu)設(shè)計中，在百時美施貴寶研究人員的一篇文獻報道中，其團隊設(shè)計和合成了一系列新型的結(jié)合 CRBN 的配體結(jié)構(gòu)，并選取當中的部分結(jié)構(gòu)用于考察和恩扎盧胺合成出靶向雄激素受體的 protac 分子。

圖 5. 36 個Protac 分子設(shè)計與合成（基于靶向雄激素受體的恩扎盧胺，6 種不同長度的 linker 及 6 種新型 CRBN 的配體的組合）^[4]

相關(guān)化合物經(jīng)HPLC進行純度快速分析^[4]

堿性體系：

Gemini NX-C18（30 mm × 2.0 mm, 5 μm）；P/N：00A-4454-B0

流速：1.8 mL/min

時間/min	A/含 0.03% 碳酸銨和 0.375% 氨水的水溶液	B/乙腈含 0.03% 碳酸銨和 0.375% 氨水
0.0	95	5
2.5	0	100
3.5	0	100

酸性體系：

Kinetex EVO C18（50 mm × 3.0 mm, 5 μm）；P/N：00B-4633-Y0

流速：2.2 mL/min

時間/min	A/水含 0.1% FA	B/乙腈含 0.1% FA
0.0	95	5
2.5	0	100
3.5	0	100

代表性 HPLC 譜圖^[4]

在醫(yī)藥界萬物皆可偶聯(lián)的新時代，基于單抗和核酸的 Protac 蛋白降解劑組合也在探索和研究中，相信隨著技術(shù)的成熟，會有越來越多的傳統(tǒng)意義上的不成藥靶點疾病被人類所治愈：一代藥物終將老去，但總有新技術(shù)在興起。

TWIN? (二合一) 技術(shù)

Gemini C18 和 C6-Phenyl

在硅膠生產(chǎn)的最后階段，我們會在上面雜化一層獨特的有機硅膠層，從而形成一種全新的復合粒子。由于內(nèi)部硅膠基質(zhì)在這個生產(chǎn)過程中不會改變，這種粒子除了保留機械強度與硬度和出色的柱效外，硅膠有機外殼還可以保護粒子免受化學物質(zhì)的侵蝕。

第二代 TWIN-NX 技術(shù)

Gemini NX-C18

TWIN-NX 使用改進型有機硅膠雜化工藝，這種技術(shù)可以形成高度穩(wěn)定的乙基交聯(lián)結(jié)構(gòu)。這些有機基團均勻地融入硅膠表面的雜化層，同時保持純凈的硅膠核。這不僅能抵抗高 pH 值的侵蝕，而且還能保持硅膠顆粒的高效性和機械強度。

Kinetex EVO C18

在 1-12 的 pH 范圍內(nèi)開發(fā)穩(wěn)定的方法

改善堿性化合物的峰形

輕松縮短運行時間并提高靈敏度

Kinetex EVO C18 采用了先進的有機硅膠雜化工藝，結(jié)合高度穩(wěn)定的乙烷交聯(lián)技術(shù)，能夠在耐受高 pH 值腐蝕的同時保持核-殼顆粒的機械強度。

參考文獻

1. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat Rev Drug Discov. 2022, 21, 181?200.

2. Proteolysis-targeting chimeras (PROTACs) in cancer therapy. Molecular Cancer. 2022, 21(1).

3. Advancing targeted protein degradation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 21, 638-654(2021).

4. Targeted protein degradation: expanding the toolbox. Nat Rev Drug Discov. 18, 949–963 (2019).

5. Design and Synthesis of Novel Cereblon Binders for Use in Targeted Protein Degradation. J. Med. Chem. 2023, 66, 16388?16409

6. 華創(chuàng)證券創(chuàng)新藥系列研究：PROTAC蓄勢待發(fā)，蛋白降解百花齊放.

7.太平洋證券創(chuàng)新無界系列之二：蛋白降解劑行業(yè)研究

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